热启动Taq酶的原理与应用

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外合成双链DNA的一种方法，其原理类似于天然DNA的复制过程，其特异性主要依赖于与其目的片段两段互补的特异引物。典型的PCR反应有三个步骤：变性，退火，延伸，经过多次循环反应，获得目的片段。

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热启动Taq酶的原理

在PCR的发展历史中，热启动酶的探索发现是制约PCR发展的重要因素，最初被运用到PCR中的酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，Klenow酶每次循环都需重新加入，过程繁琐。此后，科学家成功的从水生嗜热杆菌中提取出耐热的DNA聚合酶，该酶在90℃下反应2小时仍具有70%的活性，这就避免每次循环重新加酶的过程，提高了扩增效率，因此被广泛运用到PCR扩增中。

温度对酶活性的影响表现为双重作用，高温失活，低温抑制。普通的Taq DNA聚合酶的最适温度是72℃，此时酶的活性最佳，小于此温度，酶有较弱活性。这样，在PCR扩增由低温上升至高温的过程中（也就是温度达到变性温度时）酶发挥较弱的活性，体系极易错配或形成引物二聚体，尤其是当设计的引物3’端是G或C，错配的链很难重新解开。因此要提高PCR扩增的特异性和降低反应错配率，可以人为的控制酶的活性，在72℃之前让酶不发挥活性，这样就避免了在升温过程中（或配置反应体系）发生链的错配，从而保证扩增的特异性。Relia热启动酶就是采用化学修饰的方法封闭酶的活性中心：低温下化学小分子和酶活性中心结合，酶无活性，温度升高至95℃，两者脱离，酶活性中心暴露，开始指导体系扩增（如图一），极大的提高扩增的特异性和灵敏度。与抗体封闭的酶相比，化学修饰的酶活性维持更加稳定（抗体封闭是一种动态平衡）且无任何外源DNA污染。

图一：热启动原理

热启动Taq酶的应用

PCR能够快速特异的扩增任何已知的DNA片段，因此被广泛的应用于分子生物学的各个领域。Relia热启动酶因具有5’-3’核酸外切酶活性，可用于荧光定量PCR反应。采用热启动法扩增是提高PCR特异性的常用方法，热启动酶是很好的选择。除此之外，因其具有的高特异性高灵敏度被广泛应用到各个方面：构建cDNA文库，产生大量DNA测序，突变体分的析构建，基因分离，遗传病诊断，法医鉴定等。